L’aventure commence lorsque le mystérieux Comte Niark, un savant fou déterminé à accomplir une ancienne prophétie, kidnappe la Princesse Peach, Bowser et Luigi. Niark force Peach à se marier à Bowser de façon à unir le bien et le mal et créer le Coeur du Chaos qui détruira l’univers. Mario qui est le seul à avoir échappé à cette embrouille doit maintenant sauver ses amis des griffes du diabolique comte et sauver le monde. Tout comme les deux jeux précédents de la série Paper Mario, tous les personnages sont aussi plats qu’une feuille de papier. Cependant, Mario peut désormais manipuler l’environnement à son avantage, pour s’ouvrir de nouveaux passages ou s’offrir de nouvelles possibilités en passant à volonté de la 2D à la 3D. Cette aptitude est on ne peut plus utile à travers le jeu et est même cruciale pour progresser. Des barrières apparemment infranchissables deviennent d’un seul coup aussi fine que du papier lorsqu’elles sont vues en 3D et notre héros peut alors les franchir sans peine alors que d’effrayants ennemis en 2D révèlent leurs points faibles en 3D.

Si l’aventure débute avec Mario, vous pourrez plus tard débloquer et également utiliser la Princesse Peach, Bowser et Luigi. Chaque personnage dispose d’aptitudes spécifiques permettant de venir à bout de différents puzzles ou obstacles. En outre, des compagnons appelés Pixels, que Mario rencontrera durant son aventure, seront également là pour vous prêter main forte. Chacun de ces Pixels dispose de pouvoirs spécifiques qui seront bien utiles durant l'aventure. Parmi ceux-ci il y a Tippi, qui vous permettra d’obtenir des informations sur les ennemis ou les objets en pointant la télécommande Wii sur eux, Lanceloin qui permettra à Mario d’atteindre des endroits inaccessibles et Minus qui peut rapetisser les personnages et les rendre minuscules.